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尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)操作說明書
點擊次數(shù):4283 更新時間:2020-10-20

 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)說明書

                                                          

 

 

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存:-20℃

 

 

組分說明

 

Cat.No.              K0951      K0951A

 

KitSize               200U      5×200U

 

 Uracil-N-Glycosylase,1U/μl        200 μl    5×200 μl

 

 

產品簡介

 

     尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶),通過大腸桿菌表達純化的重組酶,該蛋白分子量為25kD,可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶,并且對RNA無活性,主要應用于防止PCR擴增產物的污染。該酶作用機理為:在PCR反應中以dUTP代替dTTP,擴增產物片段中的T全部被U取代,形成了含dU堿基的PCR擴增產物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵,降解反應體系中含U的DNA,有效消除PCR產物的殘留污染,大大降低擴增產物污染導致的假陽性,從而保證擴增的特異性和準確性。

 

單位定義

 

     37℃,60分鐘內催化1nmol尿嘧啶,從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個單位。

 

質量控制

 

     SDS-PAGE檢測純度大于95%;經檢測無核酸內、外切酶活性。

 

注意事項

 

1. UNG長期儲存(非頻繁使用; 每月少于3次)請置于-70℃保存,每天或每周使用請于-20℃保存。盡量避免反復凍融,大包裝建議分裝使用。

2.UNG可以在PCR反應前先清除不慎污染的U-DNA分子,一個實驗室必須在所有的PCR反應中使用dUTP作為dNTP之 一,使所有擴增產物都成為U-DNA。如單使用于某個檢測,T-DNA仍會積累,此抗污染系統(tǒng)也難以起到*的作用。

3. UNG/dUTP系統(tǒng)是PCR試劑內部的一種防污染措施,為了防止PCR產物的污染,尤其是在臨檢實驗室中反復放大同一片段時,必須嚴格規(guī)范實驗室的分劃和操作。  

 

 

使用方法

 

以下舉例為常規(guī)的反應體系和反應條件,實際操作中應根據具體實驗進行相應的改進和優(yōu)化。

1.  PCR反應體系:

 

試劑                     50μl反應體系               終濃度

TaqPCRBuffer,10×                   5μl                1×

dATP,10mM                       1μl              200μM 

 

dGTP,10mM                       1μl              200μM

dCTP,10mM                        1μl              200μM

    

dTTP,10mM                      0.5 μl            100μM

    

dUTP,10mM                        1μl              200μM

    

ForwardPrimer,10μM                  1μl            0.2μM

ReversePrimer,10μM                  1μl             0.2μM

 

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            ,

TaqDNAPolymerase       5U/μl         0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase,1U/μl             0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

 

    注意:TaqDNAPolymerase與Uracil-N-Glycosylase的反應緩沖液和酶儲存液可以通用。

 

2.  PCR 反應條件: 

 

     

步驟               溫度             時間

    

UNG消化          37℃-50℃        5-10min

    

預變性               95℃           10min

    

 

變性               94℃            30s

 

退火             55-65℃           30s         30-40 個循環(huán)

 

延伸              72℃           1min

    

延伸

    注意:通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應體系中,先于72℃37℃-50℃范圍內消化 5min5-10分鐘,然后95℃10分鐘滅活,(同時這一步也達到預變性和熱啟動的效果),隨后進行PCR擴增。UNG酶的反應可以在37℃-50℃,5-10分鐘的范圍內變化,可以根據實驗的需要進行調整。

 

 

實驗代做服務:

 

WB代做

HE染色

免疫熒光染色

蛋白相互作用分析

ELISA免費代檢測

免疫組化

熒光定量PCR

番紅O固綠染色

流式細胞檢測

激光共聚焦

透射電鏡服務

DNA甲基化實驗

免疫共沉淀(Co-IP)

DNA甲基化

掃描電鏡實驗

microRNA 測序

半定量RT-PCR

分子克隆和質粒載體構建服務

原位雜交(FIsh)

石蠟/冰凍切片

RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP

CCK8檢測

蛋白雙向(2-D)電泳

蛋白雙向2D-WB

ATP/ADP檢測

Taqman探針

細胞劃痕

基因組DNA提取

 

 

滬公網安備 31011802001678號

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